郭金才 吴溯帆

浙江省人民医院 整形外科 310014

【 摘要 】 目的 探索不同部位皮下脂肪细胞基础凋亡率及其局部主要诱导抑制因子 TNF － α ， IGF － 1 表达的差异，了解其在局部脂肪聚集部位特异性中的作用。 方法 对 22 例同一患者的三个不同部位（下腹部，前臂，眶隔）皮下脂肪细胞作 DNA 原位末端标记，检测其基础凋亡率，作免疫组化检测 TNF － α ， IGF － 1 的表达。 结果 不同部位基础凋亡率依次为：眶隔 ＞ 前臂 ＞下腹部，其结果有显著性差异（ P＜0.05＝； TNF － α在不同部位的表达依次为： 眶隔 ＞ 前臂 ＞下腹部，其结果有显著性差异（ P＜0.05＝； IGF － 1 在不同部位的表达依次为： 眶隔 ＜ 前臂 ＜下腹部，其结果有显著性差异（ P＜0.05＝。同一部位皮下脂肪细胞基础凋亡率与 TNF － α ， IGF － 1 的表达并无明显性别差异（ P＞0.05）。 结论 不同部位皮下脂肪细胞基础凋亡率的差异可能是局部脂肪聚集部位特异性的重要机制之一； TNF － α ， IGF － 1 作为诱导抑制脂肪细胞凋亡的主要局部作用因子，在不同部位亦存在差异性表达，可能是不同部位脂肪细胞基础凋亡率存在差异的机制。

【 关键词 】 脂肪细胞； 凋亡； TNF － α； IGF － 1

皮下脂肪的沉积有一定的部位特异性，局部脂肪聚集有其常见的好发部位，脂肪组织的体积由脂肪细胞的体积和数量共同决定。脂肪细胞曾一度被认为属于“永久细胞”，其数目在个体出生后即保持不变。 1994 年 Prins 等首次证实脂肪细胞在体外培养的过程中可因缺乏细胞因子而发生凋亡， 1997 年 Prins 等再次证实脂肪细胞具有一定的基础凋亡率。脂肪细胞的基础凋亡率是否存在部位差异，其是否为局部脂肪聚集部位特异性的机制之一； TNF － α ， IGF － 1 作为已被广泛证实的诱导抑制脂肪细胞凋亡的局部主要作用因子，其表达是否存在部位特异性，本实验拟对其进行初步的研究。

材料和方法

•  标本

    本组实验所收集标本均取自浙江省人民医院整形外科近年收治病人。所有病例均无糖尿病及其他代谢性疾病史，未服用已知的影响脂肪组织体积和代谢的药物，术前半年内体重无显著改变。下腹，前臂，眶隔脂肪均取自同一患者，其中男性 9 例，女性 13 例，年龄 19 － 45 岁，平均 28 岁。

•  实验方法

    按常规方法制备蜡块及切片，切片脱蜡入水。 DNA 原位末端标记检测脂肪细胞基础凋亡率（试剂盒购自德国宝灵曼公司）：（ 1 ） 0.3 ％甲醇－过氧化氢室温孵育 30min ，（ 2 ）滴加适量 20 μ g/ml 蛋白酶 K ，溶于 Tris/Hcl 中， pH7.4-8.0 ， 37 ℃ 湿箱中孵育 30min ，（ 3 ）标记：滴加 15 μ lTUNEL 反应混合液， 37 ℃ 湿箱中孵育 60min ，（ 4 ）信号转化：滴加转化剂 POD ， 37 ℃ 湿箱中孵育 30min ，（ 5 ）滴加 DAB 底物溶液，室温孵育 5-10min ，镜下控制染色时间。以上各步骤之间均以 PBS 冲洗 3 次，每次 5min 。（ 6 ）苏木素复染，常规脱水，透明，树胶封片，（ 7 ）对照组设置：每次实验均设对照，以反应混合液中不加末端脱氧核糖核酸转移酶的切片为阴性对照，用 Fas ， TUNEL 等方法证实有明确凋亡细胞的肝癌患者的肝组织切片为阳性对照。免疫组化检测 TNF － α ， IGF － 1 的表达按常规方法，鼠抗人 TNF － α ， IGF － 1 单克隆抗体购自武汉博士德生物工程技术有限公司。

•  结果分析

    脂肪细胞核内出现棕黄色染色可认为是凋亡阳性细胞，但必须综合以下情况共同判定：阳性细胞核表现为单个或者少数几个棕黄色的细胞核孤立地分布在组织中，阳性细胞核周围的组织形态完好，无坏死和炎症迹象。在镜下随机数 10-12 个视野，采用双人双盲法，每张切片数 1000 个细胞，数两次取其平均数。无凋亡细胞为“－”， 1%-2% 为“＋”， 3%-4% 为“＋＋”， ≥ 4% 为“＋＋＋”。 TNF － α 和 IGF － 1 表达的半定量分级为： ＜ 10% 为“－”， 20%-30% 为“＋”， 30%-40% 为“＋＋”， ≥ 40% 为“＋＋＋”。所得数据均以 SPSS 进行统计分析（ R × C 表的 ⅹ 2 检验）。

    结果

    一 . 不同部位皮下脂肪细胞的基础凋亡率

    不同部位皮下脂肪细胞均存在较低的基础凋亡率，镜下可见少数几个凋亡细胞核呈现棕黄色，孤立地分布于正常的脂肪组织中。不同部位脂肪细胞的基础凋亡率不同，依次为：眶隔＞前臂＞下腹部，经统计学检验有显著性差异（ P＜0.05）。具体结果见表1。

    表 1：不同部位皮下脂肪细胞的基础凋亡率

•  不同部位皮下脂肪细胞中 TNF － α的表达

    TNF － α主要表达在脂肪细胞质中，因细胞染色过程中脂滴被溶解，故 TNF － α的表达主要表现为细胞膜着色的深浅。不同部位脂肪细胞 TNF － α表达的程度依次为：眶隔＞前臂＞下腹部，经统计学检验有显著性差异（P＜0.05）。具体结果见表2。

    表 2：不同部位皮下脂肪细胞中 TNF － α的表达

•  不同部位皮下脂肪细胞中 IGF － 1 的表达

    IGF － 1 主要表达在脂肪细胞质中，因细胞染色过程中脂滴被溶解，故 IGF － 1 的表达主要表现为细胞膜着色的深浅。不同部位脂肪细胞 IGF － 1 表达的程度依次为：眶隔＜前臂＜下腹部，经统计学检验有显著性差异（ P＜0.05）。具体结果见表3。

    表 3：不同部位皮下脂肪细胞中 IGF － 1 的表达

    四 不同部位皮下脂肪细胞基础凋亡率及 TNF － α ， IGF － 1 表达的性别差异

    在均衡了男女性别体脂百分数（ BF ％＝ 1.51 × BMI － 0.70 ×年龄－ 3.6 ×性别＋ 1.4 （男＝ 1 ，女＝ 0 ））后，本实验发现在不同性别的相同部位皮下脂肪细胞基础凋亡率以及 TNF － α ， IGF － 1 的表达并无统计学意义上的明显差异 （ P＞0.05） 。

    讨论

    一．脂肪细胞凋亡的方法学选择

    自从 1997 年 Kerr 等首次提出凋亡的概念以来，人门对这一大多数细胞所经历的基因控制的程序性死亡过程进行了深入的研究，明确了其组织学改变包括形态生化等方面的特征及其检测方法。常用的凋亡检测方法有：形态学检测法， DNA － Ladder 法，特殊染色法以及流式细胞仪检测法。脂肪细胞中充满的大量脂滴以及极小的核 ／ 浆比值可阻止上诉凋亡特征性的胞浆形态学改变（胞膜皱缩及凋亡小体的形成），使凋亡的特征性改变极不明显，用一般的形态学检测方法很难鉴别 [1] 。再加上脂肪细胞密度较小，漂浮于液面之上，操作过程中不易洗涤和分离，使得目前公认的较为客观的流式细胞仪检测技术也不太适用于脂肪细胞凋亡的检测 [2] 。目前检测脂肪细胞凋亡的常用方法是 DNA 原位末端标记法。细胞凋亡时，核内 DNA 断裂，显露出 DNA 长链的 3 '－ OH 端，在 DNA 末端转移酶的作用下，带有标记的游离带核苷酸被转移到 3 '－ OH 端，从而可在普通光学显微镜下直接观察。 DNA 原位末端标记法的特异性和准确性均较高，可进行半定量分析，可以检测到细胞凋亡早期的 DNA 断裂，而不仅仅依赖凋亡时较晚发生的形态学改变，并减少了判断凋亡时的主观性，是目前检测脂肪细胞凋亡的最常用方法之一。随着细胞分离技术的进展和漂浮脂肪细胞培养技术的应用，流式细胞仪技术也得到了较以前更为广泛的应用 [3] 。其具有客观和可准确定量的优势，但因价格昂贵，限制了近一步的推广。

    二．局部皮下脂肪聚集部位特异性的机制

    脂肪组织 97% 的体积由脂肪细胞构成，其体积由脂肪细胞的体积和脂肪细胞的数量共同决定。脂肪细胞的体积主要由细胞内脂肪酸的多寡而定，细胞成脂溶脂能力的对比决定了胞内脂肪酸的多寡。 1998 年 Carola [4] 提出不同部位皮下脂肪细胞的成脂溶脂能力存在着明显差异，这可能是皮下脂肪聚集部位特异性的机制之一。脂肪细胞的数目与前脂肪细胞的分化，增殖以及脂肪细胞和前脂肪细胞的凋亡有关，部分学者认为可能还与脂肪细胞的去分化有关 [5] 。本实验证实在不添加任何外来影响因素的作用下，皮下脂肪细胞的基础凋亡率存在着明显的部位特异性，有统计学显著性差异（ P ＜ 0.05 ）。依次为下腹部 ＜ 前臂 ＜ 眶隔，与临床上的观察结果一致。 TNF － α ， IGF － 1 在脂肪细胞中的表达经免疫组化证实依次为下腹部 ＜ 前臂 ＜ 眶隔（ TNF － α）， 下腹部 ＞ 前臂 ＞ 眶隔（ IGF － 1 ），与 TNF － α 和 IGF － 1 分别为调节脂肪细胞凋亡局部最主要的诱导和抑制因子相符。 TNF － α 和 IGF － 1 以自分泌和旁分泌的形式结合于细胞膜上的受体，启动不同时相的 ras － MAPK 信号传导途径，诱导或抑制脂肪细胞的凋亡 [6] 。因此，皮下脂肪细胞不同水平的 TNF － α 和 IGF － 1 的表达以及由此形成的脂肪细胞基础凋亡水平的差异，可能是局部皮下脂肪聚集部位特异性的另一重要机制。

    三．局部皮下脂肪聚集的性别差异

    Illouz 根据局部皮下脂肪聚集的分布，激素的影响将其分为两类：男性型（躯干型）和女性型（肢根型）。本实验经统计学分析，下腹部，前臂，眶隔的脂肪细胞基础凋亡率以及 TNF － α 和 IGF － 1 的表达并无明显性别差异。这似与皮下脂肪聚集具有临床上的性别差异不符，可能有以下几种原因：皮下脂肪聚集虽有明显的性别差异，但不论男性或者女性，脂肪沉积的好发部位均为下腹部 ＞ 前臂 ＞ 眶隔；本组病例样本数目过小；脂肪细胞的凋亡不是皮下脂肪聚集部位性别差异的主要原因，而是以脂肪细胞体积的差异为主。 2002 年徐萍等 [7] 的研究亦证实，在儿童皮下脂肪细胞的基础凋亡中，并无明显的性别差异，其可能与男女性激素的差异在儿童中尚未充分表达有关。为探索皮下脂肪聚集性别差异的成因，可以提高样本数量，选择性别差异明显部位作进一步的研究。

参考文献 :

•  Walker NJ, Bennett RE, Kerr JFR. Cell death by apoptosis during involution of the locating breast in mice and rats. Am J Anat, 1989, 185: 19-32.

•  Walker NJ, Prins JB, Kerr JFR. Cell death by apoptosis during involution of the locating breast. Am J Anat, 1999, 285: 23-28.

•  Sorisky A, Magun R, Gagon AM. Adipose cell apoptosis: death in the energy depot. Int J Obes Metab Disord, 2000, 24: 3-7.

•  Calora U, Niesler, Prins JB, et al. Human preadipocyte display a depot-specific susceptibility to apoptosis. Diabetes, 1998, 47: 1365-1368.

•  Magun R, Boone DL, Tsang BK, et al. The effects of adipocyte differentiation on the capacity of 3T3-L1 cells to undergo apoptosis in response to growth factor deprivation. Int J Obelat Metab Disord, 1998, 22: 567-571.

•  Coppak SW. Pro-inflammatory cytokines and adipocyte tissue. Proc Nutr Soc, 2001, 60: 349-356.

•  徐 萍 , 丁综一, 杜丽蓉. 单纯性肥胖儿童和非肥胖儿童脂肪细胞基础凋亡率的研究. 中华儿科杂志, 2002, 40(5): 299-301.